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    活體細(xì)胞和組織的化學(xué)組成

    發(fā)布時(shí)間: 2010-08-04  點(diǎn)擊次數(shù): 2817次

    看清活體細(xì)胞和組織的化學(xué)組成

    zui近出版的《自然—方法學(xué)》刊登特寫文章——《無需標(biāo)記的激光特技》(Laser  tricks  without  labels),稱非線性光學(xué)顯微術(shù)可幫助科學(xué)家看到活體細(xì)胞和組織中的化學(xué)組成。文章內(nèi)容如下:

    兩年前,Annika  Enejder在她關(guān)于線蟲的脂肪貯存研究中,遇到一個(gè)令人困惑的結(jié)果。熒光顯微圖像非常清晰地表明,在用他汀類藥物處理這些蛔蟲時(shí),來自脂肪粒的信號將降低。他汀類藥物是一類被廣泛用于降低膽固醇的藥物。然而,在同時(shí)進(jìn)行的另一種顯微實(shí)驗(yàn)中,直接觀察脂肪顆粒卻看不到這樣的變化。實(shí)際上,相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)顯微技術(shù)能夠識別出脂肪顆粒,而熒光顯微技術(shù)做不到。

    其實(shí)是這么回事,用常用的Nile  red熒光染料飼喂的線蟲把這種染料當(dāng)作毒物處理了:染料被隔離到脂肪粒周圍的腸類溶酶體顆粒中,而不是脂肪粒中。實(shí)際上,這種染料還在別的方面具有誤導(dǎo)性:他汀類本身似乎會影響它的染色或者熒光。“在使用熒光基團(tuán)的時(shí)候,有很多假象要考慮到。”  來自位于瑞典查爾姆斯理工大學(xué)的Enejder說。

    沒人能夠否定熒光探針和分子染色在細(xì)胞內(nèi)行為探測上的實(shí)力,但是這種標(biāo)記辦法仍然有諸多問題。如何標(biāo)記是一個(gè)問題,尤其是對整個(gè)有機(jī)體而言。有些標(biāo)記只能在已死亡的細(xì)胞內(nèi)有作用;其他的標(biāo)記標(biāo)記方法則會損傷細(xì)胞,或者干擾所研究的生物過程。非標(biāo)記的顯微技術(shù)提供了一種能夠大幅度降低人為干擾的活體觀察技術(shù)。雖然有些技術(shù)仍然依賴內(nèi)源性熒光基團(tuán),不過它們基本上可以摒棄熒光技術(shù),也就避免遇到光漂白這個(gè)常見問題。這些新技術(shù)探測的是光在通過生物樣品時(shí)被吸收或者改變時(shí)發(fā)生的微小變化,而不是探測被激發(fā)熒光基團(tuán)的光子。這種辦法依賴在高光功率密度下觀察到的非線性光學(xué)過程。一言以蔽之,激光脈沖可以被用來“看”化學(xué)組成:脂質(zhì)里面的C-H鍵,蛋白質(zhì)里的酰胺鍵,還原態(tài)或者氧化態(tài)的生物分子,膠凝蛋白或者微管里面有規(guī)律地重復(fù)的單元。

    當(dāng)然,這樣的技術(shù)也自有其局限性:與熒光標(biāo)記能夠識別單分子相比,非標(biāo)記技術(shù)的靈敏度和特異性都要弱一些。只有特別常見的基團(tuán)才不會淹沒在一些豐富樣品產(chǎn)生的信號當(dāng)中。“這種技術(shù)的好處是,你不需要任何標(biāo)記,你只需要去成像就行了”,荷蘭癌癥研究所(Netherlands  Cancer  Institute)的生物物理學(xué)家Kees  Jalink解釋道,“但是不好的地方是,信號太弱了,你需要大量能量來照射一個(gè)細(xì)胞,而可能僅僅得到一些粗枝大葉的細(xì)節(jié)。

    非線性的眾多模式

    除CARS以外,其他可用的非標(biāo)記手段包括雙光子吸收,二次諧波產(chǎn)生(SHG)以及受激拉曼散射,每一種都有自己的配置需求和優(yōu)勢。然而,這些手段并沒有在生物學(xué)家中間閃電般地傳播開。昂貴的激光需要被耦合進(jìn)顯微鏡;光的短脈沖需要的瞄準(zhǔn)、調(diào)整和整形;探測器必須被優(yōu)化,從而能夠拾取信號,舍去背景。“組裝這些儀器需要豐富的專業(yè)經(jīng)驗(yàn);這些儀器都要求苛刻”,供職于加拿大不列顛哥倫•  比亞大學(xué)化學(xué)與工程系的Robin  F.B.  Turner這樣評價(jià)。而僅僅搭建儀器是不夠的。“你得根據(jù)每天的情況重新校準(zhǔn)”,Turner補(bǔ)充道。

    Turner說,他有充分的理由跟蹤這些技術(shù):他想知道干細(xì)胞在分化成其它細(xì)胞的時(shí)候,其中的組分如何變化,而且再也沒有比這個(gè)更好的辦法能夠研究這個(gè)問題了。“我們之所以選擇拉曼和CARS,是因?yàn)樗鼈兡軌蜃鲞@種研究而不損傷細(xì)胞”,他說。其它研究手段都會毀損細(xì)胞,得到的僅僅是在某個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的一個(gè)瞬間狀況;這樣的數(shù)據(jù)對于包含自發(fā)分裂細(xì)胞的異質(zhì)性細(xì)胞培養(yǎng)并不是十分有用,Turner補(bǔ)充道,“我們想追蹤細(xì)胞的生長”。

    同樣的優(yōu)勢在組織層次的研究上也很突出。比如,哈佛大學(xué)的Gary  Ruvkun通過對線蟲誘導(dǎo)RNA干擾篩選來研究上千個(gè)基因在脂質(zhì)生成中的角色,同時(shí)通過一種叫做受激拉曼散射(SRS)的技術(shù)來監(jiān)視這些結(jié)果。

    Ruvkun的合作者謝曉亮教授也來自哈佛大學(xué)。大約十年前,謝曉亮因?yàn)榘l(fā)布了CARS顯微術(shù)而引發(fā)了巨大轟動(dòng)。這種技術(shù)通過一種叫做自發(fā)拉曼散射的現(xiàn)象來增強(qiáng)信號。在自發(fā)拉曼散射中,樣品內(nèi)的化學(xué)鍵能夠改變通過其中的光的波長。更早使用的拉曼散射顯微術(shù)要求的激光功率很高,而且有時(shí)候需要曝光時(shí)間長達(dá)一天。謝曉亮和他的同事證明,CARS可以用于活細(xì)胞研究。通過使用兩束激光,它們的頻率差等于需要成像化學(xué)鍵的振動(dòng)頻率,細(xì)胞產(chǎn)生的微弱的拉曼信號能夠被不斷放大。“它的靈敏度比自發(fā)拉曼散射的靈敏度高了好幾個(gè)數(shù)量級”,謝曉亮說。但是CARS也有缺陷。在同一時(shí)間里,它只集中在很寬的拉曼譜中很短的一段,限制了所能采集的信號的數(shù)量;同時(shí)還帶來了很高的背景信號。從實(shí)用的角度講,這些限制意味著如果要應(yīng)用CARS技術(shù),大部分時(shí)間要基于對脂質(zhì)的探測,因?yàn)樘細(xì)滏I的大量富集能夠產(chǎn)生很強(qiáng)的特征信號。

    謝曉亮的興趣已經(jīng)轉(zhuǎn)移到了SRS,這是他和他的組員閔瑋、Christian  Freudiger共同發(fā)展出來的技術(shù),相關(guān)論文于2008年發(fā)表。“在CARS里面,信號峰位發(fā)生了移動(dòng),”謝曉亮解釋道,“這意味這我們不能使用現(xiàn)有的、數(shù)量巨大的拉曼譜數(shù)據(jù)進(jìn)行化學(xué)鑒定。”他還講到,與此相比,SRS能夠通過對激光異常迅速和地調(diào)制來去除背景噪音。這樣一來,不僅能夠得到與傳統(tǒng)拉曼光譜一樣的譜圖,而且信號強(qiáng)度高了幾個(gè)數(shù)量級,采集時(shí)間也遠(yuǎn)低于未經(jīng)放大的拉曼信號。謝曉亮說,更妙的是,SRS產(chǎn)生的信號與振動(dòng)化學(xué)鍵的數(shù)量是線性關(guān)系,這使得SRS能夠進(jìn)行定量分析。SRS技術(shù)可以應(yīng)用于實(shí)時(shí)觀測:比如在在藥物和化妝品研究領(lǐng)域,觀察維生素A酸是如何被皮膚吸收的。SRS技術(shù)還可以用于觀測酸或者酶是如何從植物細(xì)胞壁表面去除木質(zhì)素,從而提高生物燃料的生產(chǎn)效率。

    謝曉亮zui早是通過與Pfizer以及哈佛研究者的合作研究獲得對該技術(shù)的原理的證據(jù)的。謝曉亮甚至預(yù)言,SRS技術(shù)有一天會取代CARS技術(shù),然而其他研究人員對此有所保留。SRS需要對多個(gè)光源的信號進(jìn)行混合和解讀,而譜的疊加也會使去卷積變得困難。Turner說,他曾經(jīng)嘗試用SRS觀察溶液中的核酸,zui后還是決定繼續(xù)使用原來的老技術(shù)。利用那些老技術(shù),就可以從細(xì)胞的DNA里分辨出RNA。他說,盡管拉曼顯微鏡可能慢一些,“但是應(yīng)用SRS技術(shù)來擴(kuò)展我們的知識也挺費(fèi)勁的,跟使用傳統(tǒng)拉曼技術(shù)差不多。”

    采購與分享

    謝曉亮預(yù)計(jì),一旦SRS被植入商用系統(tǒng),很快就會傳播開來,他認(rèn)為早在今年底之前就會取得這樣的進(jìn)展;據(jù)報(bào)道,蔡司和徠卡已經(jīng)于去年獲得這項(xiàng)技術(shù)的授權(quán)。然而,就像熒光顯微鏡的前車之鑒,技術(shù)的傳播可能相當(dāng)緩慢。*臺商用多光子顯微鏡于1996年發(fā)布;而2003年的一項(xiàng)調(diào)查發(fā)現(xiàn),66%使用多光子顯微鏡的生物學(xué)研究仍然使用定制系統(tǒng)。現(xiàn)在,商用多光子顯微鏡則相當(dāng)普遍。

    2009年10月,適逢謝曉亮的文章發(fā)表十年,奧林巴斯宣布要提供可以安裝在多光子顯微鏡系統(tǒng)上的femtoCARS模塊。2010年1月,Newport公司展示了可以附接到激光和多光子顯微鏡上的波長擴(kuò)展單元,用以支持CARS、SHG以及其他成像方式。據(jù)悉,徠卡也將于下半年推出自己的產(chǎn)品。奧林巴斯的產(chǎn)品YiWei(Kevin)Jia宣稱,早在飛秒femtoCARS模塊發(fā)布之前,他已經(jīng)在幫助各個(gè)研究組著手搭建CARS系統(tǒng);而這個(gè)用來探測脂肪的模塊能夠讓起步更加容易。他說,如果CARS的商業(yè)化產(chǎn)品推廣像多光子顯微鏡一樣,那么銷售則能在數(shù)年之內(nèi)有一個(gè)大的飛躍。不過目前大多數(shù)應(yīng)用CARS顯微技術(shù)的主要還是物理實(shí)驗(yàn)室,而且使用的是自己搭建的系統(tǒng)。

    不過,這些研究人員已經(jīng)開始和生物學(xué)家們合作。在普渡大學(xué),生物醫(yī)學(xué)工程教授程繼新利用CARS在細(xì)胞中迅速地尋找脂肪體,然后使用同樣的光源,切換到共聚焦拉曼來做同一個(gè)區(qū)域更詳細(xì)的化學(xué)成分分析。新近關(guān)于人類前列腺腫瘤細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),先前被認(rèn)為由脂肪組成的區(qū)域,實(shí)際上是被氧化的脂肪酸。下一步是考察這種脂肪酸會否可以用于標(biāo)記前列腺癌的嚴(yán)重性。在別的項(xiàng)目中,程繼新已經(jīng)發(fā)展了一個(gè)平臺,可自動(dòng)收集CARS信號的來觀測脂肪,還利用一種叫做和頻產(chǎn)生的技術(shù)看到特定的蛋白纖維。有了這種技術(shù),程繼新及其合作者們可以研究富脂免疫細(xì)胞如何將自己嵌入到血管壁的膠原蛋白基質(zhì)中去的——這類觀測可以揭示動(dòng)脈粥樣硬化中的血塊是如何形成的。程繼新和他的同事還獨(dú)立監(jiān)測了多發(fā)性硬化癥的老鼠模型中的神經(jīng)元髓鞘,并且地指出是軸突的某個(gè)地方出現(xiàn)了損傷。他說,“以前在活體組織中對髓鞘的監(jiān)測是沒有辦法達(dá)到單細(xì)胞水平的。”
    Jalink說,髓鞘因?yàn)榫o密堆積了大量脂質(zhì),特別適合用CARS成像。非標(biāo)記顯微技術(shù)在其他方面的應(yīng)用則可能沒那么容易。他說經(jīng)常使用激光器的研究人員很可能會想辦法采用這樣的技術(shù),他補(bǔ)充道,“技術(shù)上講,這是*可行的,但是如果我能用另一種方式來獲得同樣的信息,我為什么要采用這個(gè)多少有些復(fù)雜而且昂貴的技術(shù)呢?”

    技術(shù)一旦發(fā)展起來,研究人員就能把它們應(yīng)用到新的方面。哥倫比亞大學(xué)的Rafael  Yuste利用光學(xué)手段來測量神經(jīng)電位。二次諧波發(fā)生(SHG)成像技術(shù)依賴于排列非常規(guī)則的分子產(chǎn)生的超散射光。這些分子具有*的誘導(dǎo)偶極矩,或者特定的電荷分布。Yuste對位于神經(jīng)元細(xì)胞膜這類分子非常感興趣——因?yàn)殡妶鲐灤┢渲小S捎诙沃C波信號和電場強(qiáng)度直接成比例,因而可以自動(dòng)獲得電壓信號。

    問題在于,能夠很好地實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的分子非常少。為了達(dá)到好的效果,Yuste說,“你需要非常仔細(xì)地去掃描全譜,來尋找潛在的內(nèi)源性二次諧波發(fā)色基團(tuán)。”他說,發(fā)展這種技術(shù)需要依賴學(xué)科交叉,需要研究人員在他們研究領(lǐng)域的邊緣工作。但是在現(xiàn)實(shí)中,這種工作往往在研究者們自己的系里得不到足夠的資金和支持,這也是為什么能夠?qū)崿F(xiàn)這一目標(biāo)的分子資源較少的原因。

    Enejder等人相信,學(xué)科交叉能夠幫助人們解決大量只能由非標(biāo)記的非線性顯微技術(shù)來觀測的問題。雖然Enejder的背景的是物理學(xué),她還是轉(zhuǎn)到了生物系。因?yàn)樵谀抢锟梢愿菀椎牧私馍飳W(xué)家們在成像上到底遇到了什么問題,非線性光學(xué)如何才能幫得上忙。她說,那些把自己的眼光牢牢地局限在物理系內(nèi)部的人可以繼續(xù)優(yōu)化技術(shù),但是他們或許不了解生物學(xué)家到底希望看到什么:“我就*沒有這個(gè)問題。在我眼里,應(yīng)用隨處可見。”

    當(dāng)這樣的交流變得日益重要的時(shí)候,對新實(shí)驗(yàn)的大膽嘗試也變得重要起來——而這些實(shí)驗(yàn)與物理學(xué)家們以往的經(jīng)驗(yàn)可能截然不同。在一項(xiàng)旨在制造彈性血管的生物工程項(xiàng)目中,Enejder和同事們想要監(jiān)測植入纖維素基質(zhì)的肌肉細(xì)胞的生長。與CARS一起,Enedjer和同事們利用SHG觀察了植入的細(xì)胞。他們很高興地發(fā)現(xiàn),自己可以監(jiān)測到被植入細(xì)胞是如何與纖維素網(wǎng)進(jìn)行接觸,開始生成膠原蛋白纖維的。在組織工程研究中,這種方法可以大大幫助確定*參數(shù)。盡管紙張中的植物纖維素SHG成像看不到,但是細(xì)菌分泌的植物纖維素確實(shí)擁有一種有規(guī)律的模式,能夠產(chǎn)生SHG信號,Enejder解釋說,“僅僅依賴別人文章里說的哪些可以觀測是不行的,你得自己去試才行。”

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