服務熱線
021-54479081
021-54461587
-
谷胱甘肽作為脂質過氧化損傷指標的研究
發布時間： 2010-04-29 點擊次數： 2298次谷胱甘肽（GSH）是廣泛存在于細胞內的小分子三肽化合物，它參與細胞內氨基酸轉運、糖代謝和DNA合成調節，在拮抗外源性毒物、氧自由基損傷、調節機體免疫功能、維持細胞蛋白質結構和功能、抑制細胞凋亡等方面發揮著重要作用［1］。多年來，人們試圖根據GSH被氧化還原的程度來評估氧自由基脂質過氧化損傷，并取得了不少進展。
一、谷胱甘肽的一般生理特性
GSH由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成，是細胞內呈液態、含巰基zui為豐富的一類化合物，半胱氨酸α氨基上的-SH為該分子化合物活性中心。GSH在不同臟器濃度不同，以肝內zui高，依次為脾、腎、肺、腦、心、胰和骨髓，血液中濃度zui低［2］；同一器官不同部位濃度相差亦較大，而同一細胞內不同細胞器間GSH含量亦不一致。
谷胱甘肽氧化型（GSSG）為GSH的氧化形式，在氧化劑作用下GSH通過GSH-過氧化物酶（GSH-Px）氧化成GSSG；后者通過NADPH供氫，在谷胱甘肽還原酶（GSH-Rx）作用下又還原成GSH，二者構成一動態平衡，使GSSG維持在總GSH量的1％～10％水平［3］，構成一有效的抗氧化系統。生理狀態下，GSH/GSSG維持在高比率，而在氧化應激時，GSH氧化成GSSG，GSH/GSSG比率下降，故可借以評估脂質過氧化損傷情況。
GSH合成主要在肝內，其合成除與半胱氨酸及NADPH含量有關外，其合成限速酶谷胱甘肽合成酶（GCS）亦有重要作用。GCS有2個亞基GCLR和GCLS，以GCLR為主，GCLS起調節作用。在氧化狀態，GCLR的mRNA高表達且有劑量依賴性，而低水平GSH對GCLR的mRNA影響則不明顯；相反，抑制GSH-Rx后，GCLR的mRNA則高表達，提示GSSG對GCLR有調節作用，并進而反饋性調節GSH水平［4］。GSH清除主要在腎臟，占血循環總量50％～65％，雙腎動脈中80％的GSH和GSSG經一次腎循環后被濾過，但可經Na+-依賴性GSH酶轉運系統重吸收。
二、GSH拮抗自由基脂質過氧化損傷機理
GSH在拮抗氧化性毒物中發揮重要作用，一方面可與毒物分子及其代謝物發生結合反應降低毒物毒性；另一方面可通過氧化還原反應而降低毒物過氧化的能力，使含巰基酶免于被重金屬和氧化劑激活或使已氧化的含巰基酶還原而使其恢復活性。
在自由基大量產生時，細胞膜不飽合脂肪酸氧化成脂過氧基，并引起一系列繼發損傷。GSH可直接通過供H+拮抗氧自由基毒性，終止連鎖反應，其本身則被氧化成GSSG。同樣，GSH在對抗氧自由基過氧化并抑制由此引發的細胞凋亡、壞死及自穩態改變等方面亦發揮著重要作用。
GSH/GSSG體內代謝有多種途徑，在氧化狀態下，GSH一方面被氧化成GSSG，表現為相應GSH/GSSG的降升；另一方面，GSH與外源毒物及其代謝物發生結合反應，zui終生成硫醇脲酸經尿排出，此時僅為相應GSH下降，而GSSG變化可能并不大，甚或因GSH消耗而GSSG亦降低［5］。GSSG除可被還原成GSH外，還可通過GST（谷胱甘肽-S-轉移酶）發生結合反應。
三、體內影響GSH水平因素
由于血中GSH主要源于肝臟等器官，所以血漿GSH水平無疑是間接反映有關器官，如肝、腎內GSH水平的較理想指標。目前測定仍多停留在動物實驗階段，有關人血GSH濃度報道較少，近期報道人血濃度為1.000±0.167（715例）［1］。
在許多病理情況下，如糖尿病、酒精性肝病、肝硬化、外源性毒物致過氧化時，GSH水平下降。近期又發現艾滋病、帕金森病、衰老及低氧血癥病人的GSH也下降，并發現老年人伴GSH低下者的身體健康狀況較高GSH者差。
Hagg等報道，在生理狀態下男性GSH水平高于女性，素食者高于非素食者，老年人GSH明顯下降，黑人GSH高于白種人［1，6］。另外人們還發現，GSH水平與體育活動程度及營養有關。有趣的是，吸煙者GSH高于非吸煙者，這可能是機體對長期吸煙引起慢性氧化狀態的適應性調節反應，這也進一步提示，GSH在體內抗氧化過程中的重要作用。
四、不同化學毒物誘導的脂質過氧化狀態下GSH/GSSG的變化
體外試驗顯示，當細胞暴露于亞毒性濃度毒物時，GSH并不下降而是升高。 Cookson等［7］用神經膠質細胞分別與亞毒性濃度*基錫、三乙基錫共同培養24小時，細胞內GSH顯著升高；Ochi［8］用中國倉鼠V79細胞與亞毒性濃度砷共同孵育時，發現在8小時GSH升高zui大，之后降低；另外，亦有大量試驗顯示暴露于亞毒性濃度的鉛、汞、甲基汞等化合物亦使GSH升高［9］，提示可能是細胞在應激時采取的一種保護性機制，與長期吸煙致GSH升高情況類似。
Palmeira等［10］將雄性Wistar大鼠肝細胞分別和不同毒性濃度的除莠劑百草枯和2,4-D共同進行體外培養，用Hissin酶化學法檢測GSH/GSSG。結果顯示，GSH濃度隨接觸時間而降低，孵育2～3小時降至zui低水平，且存在劑量-反應關系，而GSSG則呈正比升高。Lora等用雄性Fischer344大鼠與不同濃度的雙氯乙基亞硝脲一起孵育并采用反相液相色譜（HPLC）法檢測GSH/GSSG水平，亦得出同樣結論［11］。
而在體內實驗，情況則復雜得多。Stone等［12］以不同濃度的維生素K3（0、30、60和100 μmol/L）對鼠染毒，用Hissin-Hilf酶化學法分別測定GSH/GSSG，結果顯示GSH降低及GSSG升高具有劑量依賴關系，但GSH下降與GSSG升高不成等比例，當GSH值（μmol/g）由1.45±0.28降到0.57±0.07時（61％），GSSG此時升高僅為GSH丟失的10％。有研究用甲醇（3.0和6.0 g/kg）對雄性大鼠染毒，并分別于不同時間測其肝細胞、紅細胞及血漿GSH/GSSG，結果顯示3.0 g/kg組GSH 12小時達zui低，從4.4 μmol/g降至3.4 μmol/g（P＜0.05），其后緩慢恢復，GSH-Px、GSH-Rx活性與GSH亦同步升降，但GSSG變化則不明顯，這可能是由于GSH與新生成的甲醛直接結合而未生成GSSG［13］。另有實驗則顯示由于GSH與毒物結合，GSSG生成也減少，GSH/GSSG比率反較前升高［5，13］。
有些實驗顯示，外周血GSSG變化較GSH敏感，這可能與細胞受損后GSH、GSSG釋放到細胞外水平不同有關。Navarro等［14］對成年OF1小鼠給予1～7 Gy的高能X線照射，并在不同時間測其血中GSH/GSSG。此外，對患乳腺癌及肺癌病人在接受不同劑量放射治療時亦采用HPLC法測定上述指標，結果顯示小鼠血中GSH濃度變化不顯著，GSSG升高，GSH/GSSG下降，并與放射劑量有劑量和時間依賴性，尤以2 小時GSSG升高zui顯著；鼠肝、心、胰腺中變化亦明顯，且同時有GSH下降并有統計學意義；腫瘤放療病人結果亦顯示外周血GSSG水平則隨放療累積量增加而升高，并有顯著統計學意義，而GSH變化則不顯著。
但在以該指標評估脂質過氧化損傷時，尚需注意到GSH/GSSG系統的參與情況。Lii等［15］采用雄性SD大鼠，分別予以百草枯（20和40 g/kg）、敵草快（85和190 mg/kg）染毒，結果見肝細胞GSH和GSSG及其比率變化均無統計學意義，而此時通過檢測氧自由基脂質過氧化產物硫巴比土酸反應物，則顯示肝細胞有較嚴重氧自由基脂質過氧化損傷，這可能與蛋白質-S-谷胱甘肽化有關，GSH/GSSG 系統則可能未參與上述過程。
以GSH/GSSG作為指標評估脂質過氧化損傷，諸多實驗結果有不小差異，可能與以下因素有關：
1．測量方法：檢測GSH/GSSG方法有多種，歸納起來主要有2類：酶化學法和HPLC法。前者主要根據GSH在氧化還原過程中酶代謝動力學改變，如利用GSH被二硫代對二硝基苯氧化，生成硫硝基苯酸鹽的程度，間接反應GSH/GSSG的水平。HPLC法則可據實驗波譜直接測定GSH/GSSG，敏感性、專一性較高，但操作復雜。兩種方法的結果多數一致［1，15］，而Floreani等［16］則認為HPLC較化學法敏感10倍以上，兩方法所測結果有顯著差別，但都面臨同樣問題，如GSH/GSSG在細胞內隔窒化（compartmentilization）和樣本的預處理等。
2．質量控制：GSH接觸到空氣時，如不用穩定劑，可迅速被氧化而消耗；在不同溫度下，其穩定性亦不一，如血樣獲取后立即在-70℃冷凍，GSH至少可保持3周，但在-20～4℃，GSH逐漸降解；而加入穩定劑后，-20℃下可存放1年，室溫下亦可放置1天。所以樣品的預處理對所測結果有直接而十分重要的影響。
3．機體的多抗氧化體系和GSH/GSSG代謝的多途徑：如機體通過蛋白質-S-谷胱甘肽化、碳酸酐酶Ⅲ發揮保護細胞作用等，此時GSH/GSSG系統并未參與抗氧化代謝；生理狀態下GSH/GSSG防御系統受到諸多酶活性制約，而病理狀態下酶活性的改變亦會影響GSH/GSSG水平；GSH和GSSG還有著多種代謝途徑，如GSSG不升高，可以反映低水平脂質過氧化或低GSH含量，但亦可能因GSH與毒物直接結合而不形成GSSG或新產生的GSSG又發生新結合反應等。
綜上所述，GSH/GSSG可作為評價氧自由基脂質過氧化損傷的較敏感指標，并可借以探究毒物毒性機理，但仍需要根據毒物種類、濃度和相互作用時間等不同，對GSH/GSSG做綜合分析；此外，GSH/GSSG作為氧自由基損傷指標的研究目前仍多處于動物實驗階段，而對人體研究則較少，對其特異性的提高仍是有待解決的問題。應用到對人群的監控或對臨床中毒病人的評估仍有一定距離。
- 上一篇：實驗室日常小技巧集錦
- 下一篇：常用染料和試劑的配制與使用
產品中心
Products