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酶免疫技能對ELISA試劑盒試驗的優勢
發布時間： 2018-01-11 點擊次數： 1470次ELISA試劑盒酶免疫技能是運用酶催化底物反響的生物擴大作用，進步特異性抗原-抗體免疫學反響檢測敏感性的一種符號免疫技能。該技能所用的酶要求純度高、催化反響的轉化率高、專一性強、性質安穩、來源豐厚、價格不貴、制備成的酶標抗體或抗原性質安穩，繼續保存著它的活性部分和催化才能。在受檢標本中不存在與符號酶相同的酶。別的它的相應底物應易于制備和保存，價格低廉，有色產品易于測定，光吸收高。
一、酶和酶作用的底物
1.辣根過氧化酶（HRP）：HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，純化辦法也不雜亂。它是一種糖蛋白，含糖量約18%；分子量為44kD；是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結合而成的一種卟啉蛋白質。主酶為無色糖蛋白，在275nm波利益有zui高吸收峰；輔基是深棕色的含鐵卟啉環，
在403nm波利益有zui高吸收峰。HRP對受氫體的專一性很高，除H202外，僅作用于小分子醇的過氧化物和尿素的過氧化物。后者為固體，作為試劑較H202便利。
許多化合物可作為HRP的供氧體，在ELISA中常用的供氫體底物為鄰苯二胺（OPD）、四甲基聯苯胺（TMB）和ABTS.OPD為在ELISA中運用zui多的底物，靈敏度高，比色便利。其缺陷是配成運用液后安穩性差，并且具有致異變性。TMB無此缺陷。TMB經酶作用后由無色變藍色，目測比照明顯；加酸中止酶反響后變，可在比色計中定量；因而運用日見增多。ABTS，雖然靈敏度不如0PD和TMB，但空白值很低。
2.堿性磷酸酶（AP）：ELISA試劑盒是從牛腸粘膜或大腸桿菌中提取。從大腸桿菌提取的AP分子量為80kD，酶作用的zui適pH為8.0；用小牛腸黏膜提取的AP分子量為l00kD，zui適pH為9.6.一般選用對**苯***（p-NPP）作為底物。它可制成片狀試劑，運用便利。ELISA試劑盒產品為的對**酚，在405nm有吸收峰。用NaOH停止酶反響后，可安穩一段時間。
在ELISA中運用AP體系，其敏感性一般高于運用HRP體系，空白值也較低。但因為AP較難得到高純度制劑，安穩性較HRP低，價格較HRP高，制備酶結合物時得率較HRP低一級原因，國內涵ELISA中一般均選用HRP.3.其他的酶：有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基傘基-β-半乳糖苷，經酶水解后發作熒光物質4-甲基傘酮，可用熒光計檢測。熒光的擴大作用大大進步了辦法的敏感度。AP也可運用可發作熒光的傘基***作底物。其缺陷是需求熒光計測定，并且如用固相載體直接作為測定容器，此載體不行宣布熒光。脲酶的特色是酶作用后反響液發作pH改動，可使指示劑變色；別的，在人體內沒有內源酶。
二、ELISA試劑盒酶符號抗體或抗原
酶符號的抗原或抗體稱為結合物（conjugate）。抗原因為化學結構不同，可用不同的辦法與酶結合，如為蛋白質抗原，基本上可參閱抗體酶符號的辦法。制備抗體酶結合物的辦法一般有以下幾種。
1.戊二醛交聯法：戊二醛是一種雙功用團試劑，能夠使酶與蛋白質或其他抗原的氨基通過它而偶聯。戊二醛交聯可用一步法（如銜接AP），也可用二步法（如銜接HRP）。戊二醛一步法操作簡潔、有用，并且重復性好。缺陷是交聯時分子間的比例不嚴厲，巨細也不一，影響作用。制備HRP抗體結合物也可用二步法，即先將HRP與戊二醛作用，透析除掉戊二醛，在pH9.5緩沖液中再與抗體作用而構成酶標抗體。此法的功率可高于一步法l0倍左右。
2.過碘酸鹽氧化法：本法只用于HRP的交聯。該酶含18%碳水化合物，過碘酸鹽將其分子外表的多糖氧化為醛基。用***鈉（NaBH4）中和剩余的過碘酸。酶上的醛根很生動，可與蛋白質結合，構成爾比例結合的酶標結合物。有人以為此法為辣根過氧化物酶交聯zui有用的辦法。但也有只以為因為所用試劑較為劇烈，各批試驗成果不易重復。
按以上辦法制備的結合物一般混有未結合的酶和抗體。理論上結合物中混有游離酶不影響ELISA中zui終的酶活性測定，因通過洗刷，非特異性吸附于固相上的游離酶已被洗去。但游離的抗體則會與酶標抗體競賽相應的固相抗原，因而減低結合到固相上的酶標抗體量。因而制備的結合物應予以純化。純化的辦法較多，別離大分子混合物的辦法均可運用。硫酸銨鹽析法操作簡潔，但作用不如用sephadexg-200凝膠過濾的好。
3.符號抗體判定：ELISA試劑盒一般選用棋盤滴定法進行篩選，見第十九章。
三、ELISA試劑盒固相載體
酶免疫技能的首要試劑為固相的抗原或抗體、酶符號的抗原或抗體和與符號酶直接相關的酶反響底物。可作固相載體的物質許多，zui常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質的功能，抗體或蛋白質抗原吸附其上后保存本來的免疫活性。聚苯乙烯為塑料，可制成各種方式，在測定進程中，它作為載體和容器，不參加化學反響，加之它的價格低廉，所以被遍及選用。
聚苯乙烯載體的形狀首要有三種：小試管、小珠和微量反響板。小試管的特色是還能兼作反響的容器，zui終放入分光光度計中比色。小珠一般為直徑0.6cm的圓球，外表經磨砂處理后吸附面積大添加。如用特別的洗刷器，在洗刷進程中使圓珠滾動淋洗，作用更好。zui常用的載體為微量反響板，于ELISA測定的產品也稱為ELISA板，用的規范板形是8×12的96孔式。為便于作少數標本的檢測，有制成8聯或l2聯孔條的，放入座架后，巨細與規范ELISA板相同。ELISA板的特色是能夠一起進行很多標本的檢測，并可在特定的比色計上敏捷讀出成果。現在已有多種自動化儀器用于微量反響板型的ELISA檢測，包含加樣、洗刷、保溫、比色等進程，對操作的規范化極為有利。
杰出的ELISA板應該是吸附功能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間和同一板各孔之間功能相近。聚苯乙烯ELISA板因為配料的不同和制造工藝的不同，各種產品的質量差異很大。因而每一批號的聚苯乙烯制品在運用前須查看其功能。常用的查看辦法為：以必定濃度的人IgG（一般為10ng／ml）包被ELISA板各孔后，每孔內參加恰當稀釋的酶標抗人IgG抗體，保溫后洗刷，加底物顯色，停止酶反響后別離測每孔溶液的吸光度。操控反響條件，使各讀數在0.8左右。計算一切讀數的均勻值。一切單個讀數與均勻讀數之差應小于10%.與聚苯乙烯相似的塑料為聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯板的特色為質軟板薄，可切開，價廉、但光潔度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯對蛋白質的吸附功能比聚苯乙烯高，但空白值有時也略高。
為比較不同固相在某一ELISA測定中的好壞，可用以下辦法加以查驗：用其他免疫學測定辦法選出一個典型的陽性標本和一個典型的陰性標本。將它們別離進行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預訂的ELISA操作進程進行測定，然后比較測定成果。在哪一種載體上陽性成果與陰性成果判別zui大，這種載體就是這一ELISA測定的zui合適的固相載體。
除塑料制品外，固相酶免疫測定的載體還有兩種資料：一是微孔濾膜，如**纖維素膜、尼龍膜等，這類測定方式將在本章“膜載體的酶免疫測定"中介紹。另一種載體是以含鐵的磁性微粒制造的，反響時固相微粒懸浮在溶液中，具有液相反響的速率，反響完畢后用磁鐵招引作為別離的手法，洗刷也非常便利，但需配備特別的儀器。
四、免疫吸附劑
ELISA試劑盒固相的抗原或抗體稱為免疫吸附劑。ELISA試劑盒將抗原或抗體固相化的進程稱為包被。因為載體的不同，包被的辦法也不同。如以聚苯乙烯ELISA板為載體，一般將抗原或抗體溶于緩沖液（zui常用的為pH9.6的碳酸緩沖液）中，加于ELISA試劑盒ELISA板孔中在4℃夜，經清洗后即可運用。如果包被液中的蛋白質濃度過低，固相載體外表有能被此蛋白質*掩蓋，ELISA試劑盒其后參加的血清標本和酶結合物中的蛋白質也會部分地吸附于固相載體外表，zui終發作非特異性顯色而導致本底偏高。在這種情況下，如在包被后再用1%～5%牛血清白蛋白包被一次，能夠消除這種干擾。這一進程稱為關閉（blocking）。包被好的ELISA板在低溫可放置一段時間而不失掉其免疫活性。
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